宠物香猪猪瘟病毒的分离及RT-PCR鉴定
宠物香猪猪瘟病毒的分离及RT-PCR鉴定
  • 异类宠物
  • 2018-10-31 15:40:52
  • 来源: 
  • 目前,大家饲养宠物的热情高涨,饲养小型香猪的数量有所增加,但是,主人对家养香猪预防传染病的意识不强,猪瘟的发生有所抬头,诊断和预防香猪猪瘟病毒的感染发生,十分重要。

    【目的】:目前,大家饲养宠物的热情高涨,饲养小型香猪的数量有所增加,但是,主人对家养香猪预防传染病的意识不强,猪瘟的发生有所抬头,诊断和预防香猪猪瘟病毒的感染发生,十分重要。香猪猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是有囊膜的单股正链RNA病毒,也是引起猪瘟的病原。香猪猪瘟俗称“烂肠瘟”、以高热稽留、全身广泛性出血、脾梗死为主要特征。由于其极高的致死率以及对母猪造成繁殖障碍病,一旦流行则对饲养者造成不可估量的损失和精神打击,所以建立快速准确的猪瘟病毒亚型分离鉴定方法十分必要。

    【方法】:以山东部分地区临床病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,并对扩增的E2全长基因进行了同源性分析和系统进化树绘制。

    【结果】:我们以RNA病毒为模板,应用设计出的特异性引物扩增出一条1119bp的目的条带。将目的基因与载体连接的片段送去测序,经结果分析发现,所获得的序列与基因库中2.1b亚型CSFV同源性高达95.4%,临床病料分离株为基因亚型2.1b毒株。

    【结论】:本试验成功建立了能够分离鉴定CSFV基因亚型的RT-PCR方法。分离鉴定山东部分地区流行CSFV E2基因亚型,为猪瘟病毒的流行趋势及进化方向提供参考依据,进一步为防控猪瘟感染提供理论依据。

    关键词:香猪猪瘟病毒;E2基因;2.1b亚型;RT-PCR;分离鉴定

    【研究意义】:猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪群的一种热性或慢性、热性、高度接触性传染病。世界卫生组织OIE将其列为A类动物疫病,在我国为一类动物疫病[1]。我国是一个养猪大国,存栏量几乎占世界的一半,目前本病在我国仍时有发生,是对养猪业危害最大,最危险的传染病之一。本病是由猪瘟病毒引起的免疫抑制性动物疫病,其症状以出血和发热为主要临床特征。不同年龄、性别、品种的猪都易感,通过垂直和水平传播一年四季均可发生。临床上较难控制,治疗效果不理想。猪群免疫功能下降,疫苗剂量不足或免疫程序不当等因素都会引发猪瘟。因此鉴定猪瘟亚型并对猪瘟进行防控将十分必要,对快速确诊宠物香猪的猪瘟感染和提高宠物香猪的成活率具有重要意义。

    【前人研究进展】:目前,CSFV分3个基因型,其中2.1型可分为2.1a、2.1b、2.1c,最近几年以2.1亚型CSFV居多。国内外许多学者对猪瘟的流行现状进行研究发现,CSFV的遗传变异与E2基因的变异有关,尤其与E2基因的一些关系位点变异较大[2]。

    【本研究切入点】:本试验应用RT-PCR技术,对扩增的E2基因进行了序列同源性分析和系统进化树绘制,进而确定CSFV的亚型。通过建立猪瘟病毒亚型鉴定方法,为猪瘟病毒的流行病学情况提供依据。

    【拟解决的关键问题】:用琼脂糖凝胶和高效毛细血管电泳分析扩增产物,进行序列分析。

    1 试验材料

    1.1 病料

    根据病猪的临床剖检变化,我们采集了山东部分地区病猪的肾脏、脾脏和淋巴结等不同组织,共计20份,采集后置于零下20 ℃冻存备用。

    1.2 材料

    所用反转录酶AMV、p3Xflag-cmv-7.1载体、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、d NTPs、反转录酶、质粒提取试剂盒、DNA快速回收试剂盒等。

    1.3 仪器

    PCR仪、电泳仪、低温冰箱、凝胶成像系统等。

    1.4 菌种

    菌种均由临沂大学实验室保存。

    1.5 引物

    根据基因库的基因序列,设计了一对引物P1/P2。预计扩增长度为1119 bp。

    P1:5’-CGGAATTCATGGCACAAGCACAAGGCCGGCTAGCCTG-3’

    P2:5’-CGTCTAGATCACTTCCTCCTAACAGTGCTAC-3’

    1.6 试剂

    Solution I:

    50 mM Tris Cl (pH8.0)

    25 mM Tris Cl (pH8.0)

    10 mM Tris Cl (pH8.0)

    Solution II:

    0.2 MNaOH;

    0.1%SDS

    Solution III:

    5 M醋酸钠60 mL;

    冰醋酸11.5 mL;

    水28.5 mL

    PBS(pH7.4):

    140 mM NaCl8.2 g/L;

    2.7 mM KCL0.2 g/L;

    10 mM Na2HPO40.24 g/L;

    D.D.W1000 mL

    TE:

    10 mM Tris-HCL;

    1 mM EDTA(pH8.0)

    2 试验设计

    根据已发表的引物对E2基因进行RT-PCR扩增。

    RT反应体系(25.0 μL)为:5×Buffer5.0 μL,dNTP2.0 μL,随机引物1.0 μL,RNaseI0.5 μL,M-MuLV反转录酶0.5 μL,RNA16.0 μL;然后置于42 ℃反转录1 h。PCR反应在50.0 μL体系中进行,具体组分及扩增程序按照Chen等的方法。

    3 实验步骤

    3.1 病毒RNA 提取

    我们将组织用液氮进行研磨,然后加入Trizol,为了使其充分裂解,我们于室温放置,进行离心后弃去沉淀并加入氯仿,混匀,吸上层水相至另一离心管中,加入异丙醇,再次离心,弃上清,加入乙醇并震荡,离心弃上清,于室温晾干,用TE buffer或SDS(均须用DEPC处理)溶解RNA样品。

    3.2 RT-PCR 反应

    3.2.1 反转录

    在冰上按下列反应组分配制RT反应液:

    AMV RT 5×Reaction Buffer        4 µl

    RNase Free d H2O                6.5 µl

    d NTP Mixture (each 10 m M)       2 µl

    RNase Inhibitor                  0.5 µl

    AMV Reverse Transcriptase        1 µl

    Radom 9mers                    1 µl

    total RNA                       5 µl

    Total                           20 µl

    按下列条件进行反转录反应(PCR仪):

    30 ℃                  10 min

    42 ℃                  30 min

    99 ℃                  5 min

    5 ℃                   5 min

    反应结束后保存于4 ℃。

    3.2.2 PCR

    在冰上按下列反应组分配制PCR预反应液:

    DNTP Mixture (each 10 m M)     1 µl

    10×Extaq PCR Buffer            2 µl

    Sterilized d H2O                12.7 µl

    Extaq 酶                      0.3 µl

    P1 primer (20 µM)               1 µl

    P2 primer (20 µM)               1 µl

    cDNA                         2 µl

    Total                          20µl

    把PCR预反应液加入到反转录结束后的反应管中,轻轻混匀。按以下条件进行PCR反应:

    变性反应:94 ℃           5 min

    PCR反应:35cycles         94 ℃  

    30 sec           55-60 ℃

    30s ec           72 ℃    

    1min后反应:72 ℃           7 min

    4 ℃            备用

    扩增后的产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

    3.3 p3Xflag-cmv-7.1测序载体的构建

    3.3.1 PCR产物的回收

    用DNA快速回收/纯化试剂盒回收PCR产物。

    3.3.2 目的片段与载体的连接

    载体为p3Xflag-cmv-7.1,按顺序依次加入以下各种成分:

    p3Xflag-cmv-7.1                             0.3 µl

    已回收的PCR产物                          4.7 µl

    Solution I(含T4 DNA连接酶)               5 µl

    Total                                       20 µl

    轻轻混匀连接后的成分,经过短时间的离心后,置于16 ℃水浴过夜。

    3.3.3 重组质粒的转化

    a大肠杆菌感受态的制备:

    (1)取冻存的XL1-blue菌液2 µl加入2 ml LB培养基中37 ℃振荡培养过夜,从中再吸出100 µl加入到10 ml的新鲜LB培养基中37 ℃振荡培养2 h,使其OD600为0.2-0.4左右。

    (2)吸取1.5 ml上述菌液,加入到EP管中,冰浴10 min。2000 rpm 4℃离心7 min。

    (3)弃上清,用200 µl无菌的0.1 M CaCl2冲洗沉淀,2000 rpm 4℃离心5 min。(4)弃去上清,用200 µl无菌的0.1 M CaCl2重悬浮沉淀,冰浴30 min。

    (5)2000 rpm 4℃离心5 min。弃去上清,用100 µl无菌的0.1 MCaCl2重悬沉淀,可立即使用。

    b重组载体的转化和筛选:

    (1)加入连接后的载体,冰浴10 min。42 ℃热休克90 sec,取出后在冰上放置5 min,加入800 µl 新鲜LB培养基,37 ℃轻轻振摇荡培养1 h。

    (2)取出37 ℃气浴振荡器中已转化的菌液,2000 rpm 4℃离心1 min,留取少许上清液重悬细胞,吸取后全部加至含Amp(25 g/mL 氨苄青霉素)LB固体培养基上,均匀涂布。正面向上放置20 min,待菌液吸收后倒置37 ℃培养过夜。

    (3)挑选白色单菌落进行小瓶培养。

    3.3.4 酶切鉴定阳性克隆

    a质粒的小量提取

    按如下配方配制溶液:

    溶液I(pH8.0):

    50 mM葡萄糖;

    10 mM EDTA;

    25 mM Tris-HCl

    溶液II(pH12.5):

    0.2 M NaOH;

    1%SDS

    溶液III(pH4.8):

    5 M醋酸钠    60 mL

    冰醋酸       11.5 mL

    水           28.5 mL

    (1)吸取1.5ml阳性菌落至EP管中。

    (2)8,000 rpm离心2 min。

    (3)加入100 µl溶液I,振荡混匀。室温放置5 min。

    (4)加入200 µl溶液II,轻轻旋转EP管,混合均匀,冰浴5 min。

    (5)加入150 µl 溶液III,上下颠倒混匀,冰浴5 min。

    (6)10,000 rpm 4℃离心5 min。

    (7)将吸取的上清液移至另一新的EP管中,按25:24:1的比例加入等体积酚:氯仿:异戊醇,混匀,10,000 g 4℃离心5 min。

    (8)将吸取的上清水相移至另一新的EP管中,加850 µl无水乙醇,混匀,室温放置5 min。

    (9)12,000 rpm离心5 min,弃去上清,用1 ml70%的乙醇清洗DNA沉淀,10,000 rpm离心2 min。

    (10)弃去上清,室温干燥。

    (11)加入30 µl TE缓冲液溶解DNA沉淀,4 ℃保存。

    b限制性内切酶酶切鉴定

    依次加入下列各种物质于250 µl EP管中:

    RNase酶             0.5 µl

    d H2O               11.9 µl

    M Buffer             2 µl

    Eco R I              0.3 µl

    Xba I                0.3 µl

    质粒                5 µl

    Total                20 µl

    置37 ℃反应3~4 h,1 %琼脂糖凝胶电泳检测。

    c测序

    将酶切鉴定后连接了载体的片段送去测序。

    4 结果分析

    4.1 RT-PCR扩增及目的基因克隆结果

    对CSFV阳性病料进行E2基因的RT-PCR扩增(图1)。将目的片段进行克隆后,经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定为阳性的质粒(图2)送去测序。

    M   1    2   3    4   5   M

    注:M为2000 marker;  1-3病料中检测阳性样品;

    4为阳性对照;5为阴性对照。

    注:M为2k plusII marker; 1为pMD18-T载体EcoRI和BamHI双酶切结果

    2为阳性重组子EcoRI和BamHI双酶切结果;

    4.2 E2基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列的比对

    我们使用软件将该毒株E2基因的核苷酸序列转译成氨基酸,再从基因库下载部分1型、2型和3型CSFV序列,与其进行比较。该毒株推导的氨基酸与其他14株CSFV参考毒株的核苷酸同源性为83.6.8%~95.4%,与CAP株、Chinese-C株的核苷酸同源性为85.4%、84.9%,与HuN23-2013、0406-CH-01-TWN株同源性为95.0%和95.4%(表3)。

    表3:不同CSFV毒株E2基因核苷酸及其推导氨基酸的同源性(%)

    4.3 氨基酸位点的变异

    LY1毒株E2基因的氨基酸序列与其他毒株E2基因的氨基酸序列比对发现这些氨基酸的变异与廖素环[2]和陆增荣[3]等人研究的毒株E2基因推导的氨基酸的变异大致相同,未出现较大的变异。根据本研究毒株E2基因推导的氨基酸结果表明,693Cys、737Cys、792Cys、、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、37Arg均未发生变异,说明毒株LY1的E2蛋白空间结构及抗原结构具有较高的稳定性;但与其他株的E2蛋白比较,其G713E、N729D、K734R均发生了变异,生产上可能会导致毒株LY1与特定单抗的免疫反应失败。

    4.4 遗传进化树

    应用DNASTAR软件中MegAlign程序对15株CSFV毒株E2基因进行序列比较,并绘制遗传进化树。从遗传进化树(图4)可以看出,该CSFV毒株属于基因2型,与HuN23-2013,ZJ0801,SDZP01-2015,JSZL,0406-CH-01-TWN同属一个群,亲缘关系较近,尤其与HuN23-2013株同源性最高。而与Alfort-Tuebingen,39,CAP,Chinese-C,RUCSFPLUM亲缘关系较远。

    5 讨论

    猪瘟是一种以高热稽留、全身广泛性出血和高死亡率为特点的接触性传染病[5]。随着时间更迭,流行株不断变化,疫苗免疫失败等原因,现如今猪瘟病毒仍然是养猪业的一大隐患。由于其极高的致死率以及造成母猪繁殖障碍等不良后果,一旦感染猪瘟病毒,猪场养殖户成为首当其冲的受害者,严重损害经济利益。

    由于病毒亚型不同的关键在于氨基酸位点的不同,因此我们通过分析核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性而鉴定病毒亚型。由于CSFV的E2蛋白为CSFV主要的保护性抗原,是诱导宿主产生猪瘟病毒特异性抗体的主要抗原蛋白,更是分析猪瘟病毒基因的主要依据[6]。对其进行序列比对分析,可对CSFV毒株进行分型,并在分子水平上了解CSFV毒株主要抗原表位的变异情况[7]。所以我们根据E2基因保守序列,应用计算机软件设计了一对引物,建立了PT-PCR方法。本试验利用RT-PCR技术获取到了CSFV分离株的E2基因序列,将PCR扩增产物克隆入pMD18-T,载体,获得构建重组质粒,进行基因比对测序[8]。通过序列比对和系统遗传进化树分析,发现山东临沂地区毒株LY1与ZJ0801,SDZP01-2015,JSZL,0406-CH-01-TWN,HuN23-2013株同属一个群,同源性高、亲缘关系近,与Alfort-Tuebingen,39,CAP,Chinese-C,RUCSFPLUM等毒株的同源性较低、进化关系较远。其氨基酸变异分析表明,LY1毒株发生的变异与近几年流行毒株发生的变异并未出现较大差异。

    能够鉴定猪瘟病毒的方法很多,我们在这里使用RT-PCR方法来检测猪瘟病毒。其优点在于灵敏度高,能够在感染早期就可进行鉴定,具有早期微量的便利条件,且能确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染;特异性强,能避免传统血清学方法不能解决的交叉反应问题。而ELASA对检测样品的要求高,倘若病料保存不当,容易出现假阴性的结果。所以综合考虑最适宜选择检出率高、准确性好的RT-PCR方法来检测猪瘟病毒亚型。本方法的建立对于猪瘟病毒亚型的早期诊断有一定的参考意义。

    6 结论

    本研究结果表明,我们根据E2基因设计的一对引物能够鉴定猪瘟病毒。对采集的毒株通过RT-PCR测序后发现该毒株与ZJ0801,SDZP01-2015,JSZL,0406-CH-01-TWN,HuN23-2013株同属一个群,同源性高、亲缘关系近,而与Alfort-Tuebingen,39,CAP,Chinese-C,RUCSFPLUM等毒株的同源性较低、进化关系较远。LY1与2.1b HuN23-2013株同源性最高,表明引起发病的病原是猪瘟病毒2.1b亚型。证明近期山东部分地区CSFV流行毒株仍以2.1b亚型毒株为主,该结论既丰富了CSFV分子流行病学调查内容,又对2.1b亚型猪瘟病毒防制提供了参考依据。

    参考文献

    [1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].第二版.北京:科技出版社,1997.652~664.

    [2]吴旭锦,朱小甫,徐德乾,等.陕西省猪瘟流行毒株E0和E2全基因分子特征分析[J].西北农林科技大学学报,2012.40(7):25~31.

    [3]廖素环,罗廷荣,吴显实等.广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析[J].中国生物制品学杂志,2005.18(3):196~199.

    [4]陆增荣,张民秀,肖雄,等.广西猪瘟病毒CSFV E2基因克隆及序列分析[J].南方农业学报,2012.43(4):528~531.

    [5]欧莹.2012-2013年广西猪瘟流行病学调查[D].南宁:广西大学,2014.

    [6]赵耘,王在,王琴,等.23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析[J].中国兽医科技,2002.32(3):3~6.

    [7]傅彩霞,郑瑞峰,郭峰,等.北京部分地区猪瘟病毒流行毒株E2基因序列分型[J].动物医学进展,2012.33(1):61~66.

    [8]Ma L,Fu W,He Q S,Xu X K,Yi C H,Sun X X,Jiang J X,Huang S B,Xiong Y..Development of TaqMan fluo-rescent quantitative PCR method for detecting classicalswine fever virus(CSFV)[J]. Guangxi Agricultural Sci-ences,2010.41(11):1223~1225.


    72小时热文
    品牌专栏
    热点资讯
    • 每日
    • 本周
    • 本月